磁珠對PCR抑制原因與解決方案 2020/01/07

導讀:然而不同實驗的洗脫效率對最終核酸分子的回收率有很大的影響(Tips:尤其在探針捕獲領域)。因此,為降低洗脫不完全以及洗脫試劑造成的污染,將捕獲了核酸的磁珠直接進行PCR擴增,成為越來越多分子診斷與測序中常用的實驗手段。也行有不少研究者發現,帶磁珠進行PCR擴增,會對PCR產生抑制作用,Dr. BEAVER這次為大家驗證了磁珠抑制PCR的原因,以及解決方案。

隨著精準醫療的發展以及二代測序成本的降低,分子診斷的市場需求逐年上升。磁珠作為分子診斷中核酸提取、探針捕獲等實驗的重要原材料,為其實現高回收率、自動化發揮了重要的作用。

然而不同實驗的洗脫效率對最終核酸分子的回收率有很大的影響(Tips:尤其在探針捕獲領域)。因此,為降低洗脫不完全以及洗脫試劑造成的污染,將捕獲了核酸的磁珠直接進行PCR擴增,成為越來越多分子診斷與測序中常用的實驗手段。也行有不少研究者發現,帶磁珠進行PCR擴增,會對PCR產生抑制作用,Dr. BEAVER這次為大家驗證了磁珠抑制PCR的原因,以及解決方案。

那磁珠抑制PCR的可能性因素有哪些呢?

1.磁珠品牌;
2.磁珠使用量;
3.磁珠Fe離子泄露;
4.磁珠表面材質及電荷的影響;
此研究還有很多需要改進的地方,大家可在下方留言,共同探討。

不同品牌的SA磁珠對PCR的影響
我們選用了進口磁珠以及兩種品牌的國產鏈霉親和素磁珠(SA磁珠)驗證其對PCR的影響。結果出乎意料,進口T1磁珠對PCR的抑制效果最為明顯。SA-1磁珠對PCR的影響強于SA-2磁珠。

圖1.不同品牌的磁珠(1 mg beads/50μL PCR)均對PCR具有不同程度的抑制。

不同濃度的SA磁珠對PCR抑制效果
為了驗證不同磁珠使用量對PCR的抑制情況,我們選用了兩種SA磁珠,控制PCR體系中SA磁珠的濃度。結果顯示,低濃度磁珠對PCR的抑制很少,甚至可略微增強PCR反應效率,但隨著磁珠濃度增加,對PCR抑制作用顯著上升。當磁珠濃度達到0.5mg/50μL PCR時,抑制作用開始明顯,SA-1磁珠對PCR的影響強于SA-2磁珠(與上述結論相同)。

圖2:兩種不同濃度的SA磁珠投入PCR體系中,PCR產物的電泳圖。

Fe離子泄露對PCR的抑制作用
資料報道10μM 以上濃度的Fe離子會強烈抑制PCR。若磁珠在PCR過程中有鐵離子的滲出,則會導致對PCR的抑制。上述實驗表明1mg/50μL PCR的磁珠均會對PCR產生抑制。但Fe離子泄露實驗證明SA-2磁珠無Fe離子泄露,但仍然會抑制PCR反應。

圖3:采用鄰菲啰啉法檢測檢測2種SA磁珠在PCR產物中Fe離子的濃度。

不同表面材質及電荷的磁珠對PCR的抑制效果
本次實驗我們選用2種不同表面的磁珠,其中一款為二氧化硅羥基表面。另外一款為聚合物羧基表面。兩種磁珠在PCR體系中均無Fe離子泄露,但都對PCR產生抑制,其中二氧化硅羥基磁珠更為明顯。

圖4:相同濃度二氧化硅羥基磁珠以及聚合物羧基磁珠(1mg beads/50μL PCR)PCR之后的產物電泳圖。

圖5:兩種磁珠在PCR體系中均無Fe離子泄露。磁珠抑制作用與漏鐵無明顯相關性。磁珠對PCR的抑制原因,更有可能是其表面材質(或電荷)對PCR有抑制作用。

磁珠對PCR抑制解決方案:
總而言之,對PCR體系抑制是絕大部分的磁珠都存在的現象。海貍研發團隊為了解決以上問題,配合磁珠試劑,開發了一款能夠消除磁珠對PCR影響的PCR增強試劑,能夠明顯降低磁珠對PCR的影響。


圖6.control為正常PCR產物,1、2、3、4為PCR體系中添加4種不同磁珠的PCR產物。1、2、3、4-Enhancer是在PCR體系中加入以上4中磁珠及4μL的增強試劑后PCR產物。

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海貍公司創立于2011年底,落戶在風景秀麗的蘇州工業園區獨墅湖畔生物醫藥產業園(BioBAY)。公司以納米磁珠技術和生物材料表面技術為核心,通過試劑開發和設備技術整合,面向生物科研、體外診斷和基因檢測領域,提供科研和工業級別的納米磁珠原料、蛋白偶聯中間體、免疫磁珠、核酸提取試劑盒、輔助生物耗材及配套自動化設備等系列產品。

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